Cari Blog Ini

Selasa, 08 Maret 2011

Sterilisasi

PENDAHULUAN

Latar Belakang
Sterilisasi alat gelas dan metal dapat dilakukan dengan pemanasan melalui oven. Agar terbebas dari bakteri yang resisten dan partikel spora, pemanasan harus dapat dilakukan terus menerus dalam waktu yang panjang. Perlu diketahui sumber kontaminan juga sangat mempengaruhi hal tersebut, dalam satu genus bakteri ketahanan terhadap panasnya pun berbeda. Seandainya kontaminasi terjadi sangat parah dan sering terjadi maka disarankan semua peralatan dan botol kultur disterilisasi pada suhu 160-180 oC selama 3 hari dan ruang transfer, ruang kultur juga dibersihkan dan disterilisasi kembali. Lalu alat di autoclaf dengan suhu 121OC selama 1 jam. Sinar UV digunakan untuk sterilisasi ruangan (Santoso dan Fatimah, 2002).
Pada teknologi bioproses, alat-alat fermentasi, pipa, dan alat penunjang serta nutrient dan substrat harus disterilisasi terlebih dahulu. Sterilisasi adalah proses panas untuk mematikan semua mikroba dan merusak spora, sehingga produk bebas dari mikroba pathogen dan lama daya awetnya. Sterilisasi adalah pengurangan mikroba kontaminan sampai tingkat tertentu (Suharto, 1995).
Pada ruang penanaman ditemukan banyak media biakan dan beberapa plantlet yang akan dikulturkan kembali. Salah satu alat terpenting pada ruang penanaman ini adalah laminar air flow yang merupakan ruang khusus menanam dilengkapi dengan sinar UV dan peralatan lain didalamnya yang mendukung proses penanaman. Ruang induksi merupakan ruang paling steril diantara semua ruangan yang ada. Ruang ini digunakan untuk meletakkan bahan kultur yang sudah ditanam hingga menjadi tanaman kecil. Suhu pada ruangan ini diatur sedemikian rupa sehingga dapat mendukung pertumbuhan tanaman (http://kulturjaringan\imgres.htm, 2009).
Dewasa ini beberapa media kultur jaringan dapat dibeli dalam bentuk bubuk yang telah dipersiapkan. Tergantung dari media kultur jaringan ada yang hanya mengandung garam makro serta vitamin, ada juga yang lengkap sampai hormon dan gula. Formula ini memang memudahkan pekerjaan. Namun, suatu penelitian atau pembuatan media untuk komoditi (jenis tanaman) yang memerlukan perubahan komposisi dalam satu atau beberapa komponen maka pemisahan komponen-komponen penyusun media perlu dilakukan (Nugroho dan Heru, 2000).

Tujuan Percobaan

Adapun tujuan dari percobaan adalah untuk mengetahui cara-cara sterilisasi alat, media dan bahan tanaman dan untuk mengetahui prosedur pembuatan media MS (Murashige dan Scock) dan juga jenis-jenis media.
Kegunaan Penulisan
Sebagai salah satu syarat untuk dapat mengikuti Praktikal Tes di Laboratorium Bioteknologi Pertanian, Fakultas Pertanian, Universitas Sumatera Utara, Medan.
Sebagai bahan informasi bagi pihak yang membutuhkan.
TINJAUAN PUSTAKA
Kultur jaringan tumbuhan umumnya menggunakan in-vitro dan pertumbuhan di luar tubuh induknya untuk defenisinya yang dilakukan dalam media nutrisi. Beberapa fasilitas dasar yang menjadi bagian dalam kultur jaringan adalah: daerah cuci, daerah persiapan media, daerah penanaman, daerah pertumbuhan, dan daerah penelitian dan uji coba (Ramawat, 2000).
Media kultur jaringan yang kita gunakan untuk kultur jaringan terdiri atas 3 komponen dasar, antara lain:
Unsur esensial atau bahan mineral yang menyediakan campuran kompleks garam-garam mineral
Suplemen yang organik yang menyediakan vitamin atau asam amino
Sumber karbon tetap biasanya dalam bentuk sukrosa (Slater, et all., 2003).
Tanaman dapat diperbanyak secara vegetatif menggunakan teknik kultur in-vitro dengan teknik kultur kalus atau kultur sel. Jika suatu eksplan ditanam pada medium padat atau dalam medium cair yang sesuai, dalam waktu 2-4 minggu, tergantung spesiesnya, akan terbentuk massa kalus yaitu suatu massa amorf yang tersusun atas sel-sel parenkim berdinding sel tipis yang berkembang dari hasil proliferasi sel-sel jaringan induk. Kalus dapat disub-kultur dengan cara mengambil sebagian kalus dan memindahkannya pada medium baru. Kalus dapat dikembangkan dengan menggunakan eksplan yang berasal dari berbagai sumber, misalnya tunas muda, daun, ujung akar, buah dan bagian bunga (Yuwono, 2008).
Kultur biasanya dibuat dari bagian tertentu suatu tanaman. Bagian tersebut disebut explan dan dapat diperoleh dari berbagai bagian organ seperti daun, akar dan endosperma. Terutama sel yang lebih muda, lebih mudah dan efektif untuk berkembang/tumbuh. Kultur kalus adalah sisi yang sangat penting dalam bioteknologi tumbuhan. Kultur kalus dapat juga digunakan untuk menandakan suspense sel, dengan menggunakan varietas dari pelajaran transformasi tumbuhan (Bennet and Sharman, 1989).
Media tanam harus berisi semua zat yang diperlukan untuk menjamin pertumbuhan eksplan. Bahan-bahan yang diramu berisi campuran garam mineral sumber unsur makro dan unsur mikro, gula, protein, vitamin, dan hormone tumbuhan. Berhasilnya kultur jaringan banyak ditentukan oleh media tanam. Campuran media yang satu, dapat cocok untuk jenis tanaman tertentu, tetapi dapat kurang cocok untuk jenis tanaman yang lain (Rahardja, 2001).
Untuk mendeferensiasikan suatu kalus agar dapat tumbuh akar dan tunas, kita dapat menggunakan medium apa saja, asal sesuai dengan medium induksi kalus yang sebelumnya digunakan. Bila memakai medium MS maka akan lebih baik bila konsentrasi medium deferensiasi separuh dari medium induksi kalus. Selain itu, zat pengatur tumbuh 2,4-D atau NAA harus dihilangkan, sebab bila belum hilang akan tetap menjadi kalus saja, tidak akan tumbuh tunas (Hendaryono dan Wijayani, 2004).






BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Percobaan
Percobaan dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Pertanian, Fakultas Pertanian, Universitas Sumatera Utara, Medan. Pada ketinggian ± 25 m dpl pada hari rabu tanggal 17 Februari 2010 pada pukul 14.00 WIB sampai selesai.
Bahan dan Alat
Adapun bahan yang digunakan pada percobaan sterilisasi ini adalah alkohol 96%, untuk mensterilkan alat dan eksplan, aquadest steril untuk mencuci eksplan, eksplan sebagai bahan tanam, bahan kimia untuk sterilisasi, aluminium foil untuk menutup botol kultur, NaOH 0,1 N untuk menaikkan pH media, HCL 0,1 N untuk menurunkan pH media, air untuk mencuci bahan tanaman, agar sebagai pemadat media. Adapun bahan-bahan kimia untuk pembuatan larutan stock antara lain;
I.Makro nutiren (Stock I)
NH4NO3 1650,0 mg/l
KNO3 1900,0 mg/l
CaCl2. 2H2O 440,0 mg/l
MgSO4.7H2O 370,0 mg/l
KH2PO4 170,0 mg/l
(NH4)2SO4 -
NaH2PO4.H2O -
II.Mikro nutrien (Stock II)
- MnSO4.4H2O 22,3 mg/l
KL 0,83 mg/l
MnSO4.H2O -
H3BO3 6,2 mg/l
CaCl2.6H2O 0,025 mg/l
Na2M0O4.2H20 0,25 mg/l
CuSO4.5H2O 0,025 mg/l
ZnSO4.4H2O 860,0 mg/l
III.Iron (Stock III)
FeSO4.7H2O 27,8 mg/l
Na.EDTA 37,3 mg/l
IV.Vitamin (Stock IV)
Nicotinin acid 0,5 mg/l
Inositol 100,5 mg/l
Pyridoxine HCL 0,5 mg/l
Thiamin HCL 0,1 mg/l
Sukrosa. 30.000,0 mg/l

Adapun alat yang digunakan pada percobaan adalah autoklaf untuk sterilisasi alat dan media, lampu ultraviolet untuk sterilisasi ruangan, sprayer ultraviolet untuk sterilisasi ruangan, timbangan analitik untuk menimbang bahan, beaker glass untuk mengukur bahan, petridish untuk tempat bahan tanaman, pipet ukur untuk mengukur tanaman yang diteteskan, pemanas untuk memanaskan media, pH meter untuk mengukur tinggi rendahnya pH, batang pengaduk untuk mengaduk larutan, autoklaf untuk sterilisasi alat dan laminar air flow dan media, cawan petri untuk meletakkan eksplan, Erlenmeyer sebagai wadah eksplan yang sudah dicuci, Laminar Air Flow sebagai tempat penanaman eksplan, botol kultur untuk tempat media, gelas ukur untuk mengukur larutan, botol alkohol untuk tempat alkohol, sprayer untuk menyemprot alkohol, kertas label sebagai penanda, cutter untuk memotong bahan tanaman.
Prosedur Percobaan
A.Sterilisasi Alat-alat
Disterilkan alat-alat yang dipergunakan seperti botol, erlenmeyer, petridish, pinset,dll di dalam autoklaf dengan suhu 121°C dan dengan tekanan 17,5 psi selama 1 jam (60 menit).
Dibersihkan Laminar Air Flow (tempat penabur) juga harus steril dengan menggunakan alkohol 96% atau disemprot dengan sprayer.
Dinyalakan lampu ultra violet (UV-Lamp/germicidal UV-Lamp) untuk sterilisasi ruangan.
B.Sterilisasi Media
Disterilkan media di dalam autoklaf pada tekanan 17,5 psi dan suhu 121°C selama 30 menit
Dikurangi tekanan pada autoklaf perlahan-lahan hingga tekanan dalam autoklaf mencapai nol.
Diletakkan media pada rak simpan media hingga siap pakai.
C.Sterilisasi Eksplan
Dicuci potongan organ yang akan dijadikan eksplan dengan air bersih, dicuci 2-3 kali, lalu diletakkan di dalam cawan petri atau erlenmeyer.
Ditimbang zat kimia yang akan digunakan untuk sterilisasi dan dilarutkan dalam aquadest steril sesuai dengan persentase yang dikehendaki.
Dibersihkan kedua bahan tersebut kedalam LAF dengan alkohol 96%.
Dimasukkan potongan organ/eksplan yang akan disterilisasi kedalam larutan pensteril sampai waktu yang dikehendaki. Selama itu erlenmeyer digoyang atau dishaker agar semua organ dapat kontak langsung dengan pensteril.
Dicuci eksplan tersebut dengan aquadest steril 2-3 kali, kemudian dipotong kecil-kecil dengan ukuran 0,5-1 cm, eksplan selanjutnya sudah siap untuk ditanam.


D.Sterilisasi Ruangan
Disiapkan lampu UV di tengah meja
Dihidupkan dari jarak jauh
Ditunggu 24 jam
Dimatikan lampu UV dari jauh
Ditunggu selama 1 jam
Ruangan siap digunakan.
E.Penanaman Eksplan
Diambil eksplan dengan menggunakan pinset dan diletakkan di dalam petridrish, eksplan dipotong-potong dengan scalpel.
Dimasukkan potongan eksplan ke dalam erlenmeyer atau botol berisi media, sehingga permukaan yang teririt dapat bersentuhan dengan media.
Ditutup erlenmeyer atau botol dan diinkubasikan pada ruang inkubator sesuai dengan suhu dan intensitas cahaya yang dikehendaki.




HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil

Dari hasil percobaan di dapat bahwa alat-alat eksplan dan media dalam keadaan steril. Ini ditandai dengan tidak adanya mikroorganisme dalam media. Media tanam steril ditandai dengan tidak munculnya jamur.
Dari hasil percobaan diperoleh bahwa media yang digunkan adalah media MS dengan penambahan ZPT 2,4 D sebanyak 250 botol kultur dan media MS 0 (tanpa ZPT) sebanyak 250 botol kultur untuk kultur anther.
Pembahasan

Dari hasil percobaan diketahui bahwa proses sterilisasi ruangan dapat dilakukan dengan menggunakan sinar UV (ultraviolet) yang dikeluarkan oleh lampu sinar UV. Sterilisasi ini dilakukan dengan dengan meletakkan lampu UV di tengah ruangan kemudian dihidupkan pada jarak jauh maka ditunggu selama 1 jam dulu sebelum ruangan dapat digunakan. Hal ini sesuai dengan literatur Santoso dan Fatimah (2005) yang menyatakan bahwa untuk sterilisasi ruangan digunakan lampu sinar Ultraviolet (UV).
Media yang telah dibuat dapat disimpan, tapi apabila dalam penyimpanan media tersebut mengendap maka tidak dapat digunakan lagi. Untuk mencegak agar medianya tidak cepat mengendap maka media yang dibuat dicampurkan dengan konsentrasi yang tidak terlalu tinggi. Apalagi bila di kontaminasi mikroba maka media tersebut sudah tidak dapat dipakai lagi. Hal ini sesuai dengan literatur Nugroho dan Heru (2000) yang menyatakan bahwa dalam penyimpanannya larutan yang telah mengalami pengendapan tidak dapat digunakan lagi pengendapan umumnya terjadi bila kepekatan larutan terlalu tinggi, scock yang terkontaminasi juga tidak dapat dipakai lagi.
Media yang diperoleh dalam percobaan terdiri dari 4 bagian, yaitu scock I (makronutrien), scock II (mikronutrien), scock III (Iron) dan scock IV (vitamin) yang semuanya mengandung senyawa-senyawa yang diperlukan sebagai hara bagi tumbuhan yang akan tumbuh (explants). Hal ini sesuai dengan literatur Nugroho dan Heru (2000) yang menyatakan bahwa pembuatan larutan scock berdasarkan pengelompokan yaitu larutan scock makro, scock mikro, vitamin dan iron.
Dalam sterilisasi alat dan media serba peralatan gelas digunakan autoclaf, pada tekanan 17,5 psi dan suhu 121oC selama 1 jam (untuk alat) dan 30 menit (untuk media). Hal ini sesuai dengan literatur Santoso dan Fatimah (2005) yang menyatakan bahwa pemanasan oven 160 - 180oC selama 3 hari dapat disetarakan dengan pemanasan dalam autoclaf selama 1 jam untuk alat dan selama 30 menit untuk media dengan suhu 121oC dan tekanan 17,5 psi.
Sterilisasi explan menggunakan aquadest steril dan alkohol. Hal ini bertujuan agar explan yang akan digunakan terbebas dari mikroorganisme dan zat kontaminan sehingga pertumbuhan explan menjadi bagus dan resiko kegagalan lebih rendah. Hal ini sesuai dengan literatur Bennet and Sharman (1989) yang menyatakan bahwa explan yang digunakan untuk percobaan haruslah disterilkan dari mikroorgaisme yang mengkontaminasinya dengan menggunakan alkohol.
Dari hasil percobaan di dapat bahwa sterilisasi alat dilakukan dalam autoclaf pada suhu 121oC dan tekanan 17,5 psi selama 1 jam, sedangkan sterilisasi media hanya 30 menit. Hal ini dikarenakan media yang terlalu lama di sterilisasi dapat menyebabkan penguraian gula dan vitamin pada eksplan. Hal ini sesuai dengan literatur Santoso dan Fatimah (2005) yang menyatakan bahwa pada sterilisasi media dilakukan pada suhu 121oC dan tekanan 17,5 psi dan selama 30 menit untuk menghindari penguraian gula.
pH pada media harus 5,7 – 5,8 agar sesuai dengan keadaan tumbuh explan, keadaan ini tidak terlalu asam/basa tapi sedang saja dan mendekati netral. Hal ini sesuai dengan literatur Yuwono (2008) yang menyatakan bahwa pertumbuhan explan dipengaruhi oleh keasaman media, media yang terlalu asam/basa dapat menghambat pertumbuhan explan.







KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
1.Dari proses sterilisasi bahan diperoleh bahan yang steril dan bersih (bebas dari kontaminan) dengan autoclaf.
2.Dari proses sterilisasi media diperoleh media yang steril.
3.Untuk mensterilkan ruangan menggunakan lampu UV.
4.Untuk sterilisasi LAF digunakan alkohol 96% dengan menggunakan sprayer.
5.MS adalah media dasar yang dipakai dalam pembuatan media karena kaya hara organik.
6.Sterilisasi dilakukan dalam autoclaf pada suhu 121oC tekanan 17,5 psi selama 1 jam pada alat dan 30 menit pada media.
7.Dihasilkan MS dengan penambahan ZPT 2,4 D sebanyak 250 botol untuk media kultur kalus dan MS 0 (tanpa ZPT) sebanyak 250 botol untuk media kultur anther.

Saran
Sebelum kita melakukan praktikum, sebaiknya kita terlebih dahulu mengetahui dan mengenal alat-alat yang terdapat dalam laboratorium.


DAFTAR PUSTAKA
Bennet, A.B and Sharman, D.O., 1989. Horticultural Biotechnology. John Willey and Sonslac, New York.

Hendaryono, D.P.S dan Wijayani, A., 2004. Teknik Kultur Jaringan. Kanisius. Yogyakarta

Http://Kulturjaringan\imgres.htm, 2009. Kultur jaringan Diakses tanggal 16 Februari 2010.

Nugroho, A dan Heru, S. 2000. Pedoman Pelaksanaan Tenik Kultur Jaringan. Penebar Swadaya, Jakarta.

Rahardja, P.C., 2001. Kultur Jaringan. Penebar Swadaya. Jakarta.

Ramawat, K.G., 2000. Plant Biotechnology. S.Chand dan company Hd, New Delhi.

Santoso, U dan Fatimah, N., 2002. Kultur Jaringan Tanaman. Umm-Press, Jakarta.
Slater, A., Nigel, W., Scott and Mark, R.F., 2003. Plant Biotechnology. Oxford University Press. New York.
Suharto, 1995. Bioteknologi dalam Dunia Industri. Andi Offset. Yogyakarta.
Yuwono, T., 2008. Bioteknologi Pertanian. UGM-Press, Yogyakarta.

Tidak ada komentar:

Posting Komentar